abts测定正常值是多少_abts测定方法

       今天，我将与大家分享关于abts测定正常值是多少的最新动态，希望我的介绍能为有需要的朋友提供一些参考和建议。

1.abts�ⶨ����ֵ�Ƕ���

2.抗氧化结果分析 单位方面问题

3.细胞凋亡的免疫学检测方法有哪几种（注意是免疫学的方法）

4.蔗根和鱼腥草是同一物吗

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       ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

       (一) 原理

       ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

       (二) 操作步骤

       方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

       1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

       2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

       3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

       4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

       5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

       6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

       方法二 用于检测未知抗体的间接法：

       用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

       每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

       ↓

       加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔

       中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

       ↓

       于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，

       37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

       ↓

       其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

       (三) 试剂器材

       1. 试剂

       (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

       Na?CO3 1.59克

       NaHCO3 2.93克

       加蒸馏水至1000ml

       (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M

       KH2PO4 0.2克

       Na2HPO4·12H2O 2.9克

       NaCl 8.0克

       KCl 0.2克

       Tween-20 0.05％ 0.5ml

       加蒸馏水至1000ml

       (3) 稀释液：

       牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

       加洗涤缓冲液至100ml

       或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

       (4) 终止液(2M H2SO4）：

       蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

       (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):

       0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml

       0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml

       加蒸馏水50ml。

       (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:

       TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml

       底物缓冲液(PH5.5) 10ml

       0.75％H2O2 32μl

       (7) ABTS使用液:

       ABTS 0.5mg

       底物缓冲液(PH5.5) 1ml

       3％H2O2 2μl

       (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。

       (9) 正常人血清和阳性对照血清。

       2. 器材:

       (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

       (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

       (3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

       (四) 注意事项

       1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

       2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

       (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

       （2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

       (3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

       (4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

抗氧化结果分析 单位方面问题

       这个得具体问题具体分析。看你想达到什么检测目的了，另外还得看是什么病毒，存在于动植物什么部位。最简单的就是沉积实验：用标准抗原免疫鼠或兔等使其产生抗体，再用其血清作个沉积实验就可以了。这个实验不敏感，需要抗原抗体量较大，如果是特殊病毒或是感染初期，则检测不到。如果你有条件的话可以做ELISA，这个实验敏感性强。

       一,基本原理

       它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.

       在这种测定方法中有3种必要的试剂:

       ①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)

       ②酶标记的抗原或抗体(标记物)

       ③酶作用的底物(显色剂)

       测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,

       再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色.

       其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比.

       这种有色产物可用肉眼,光学显微镜,电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定.

       其方法简单,方便讯速,特异性强.

       二,酶及其底物

       酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物.是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物 ,将得到不同的颜色反应.

       360,450

       420

       荧光

       **

       甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

       硝基酚半乳糖苷(ONPG)

       β-D-半乳糖苷酶

       405

       420

       **

       深蓝色

       ABTS+HRP+葡萄糖

       葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰

       葡萄糖氧化酶

       400

       500

       **

       红色

       4-硝基酚磷酸盐(PNP)

       萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐

       碱性磷酸酯酶

       492

       460

       449

       425

       642

       橘红色

       **

       棕色

       兰色

       蓝绿色

       邻苯二胺

       四甲替联苯胺

       氨基水杨酸

       邻联苯甲胺

       2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

       辣根过氧化物酶

       测定波长

       显色反应

       底 物

       酶

       ELISA的种类和变化

       (一)双抗体夹心法

       (二)间接法

       (三)竞争法

       (四)双位点一步法

       (五)捕获法测IgM抗体

       (六)应用亲和素和生物素的ELISA

       (一)双抗体夹心法

       此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原

       获得待分析物的未标定抗体

       将特异性抗体与固相

       载体连接形成固相抗体

       洗涤除去未结合的

       抗体及杂质

       加入封闭蛋白溶液以封闭载体

       表面残留的蛋白结合位点

       洗涤并除去未结合的封闭蛋白

       加受检标本(抗原)形成

       固相抗体-抗原复合物

       洗涤除去其他

       未结合的物质

       加酶标抗体生成

       抗体—待测抗原—酶标记抗体

       的复合物

       彻底洗涤

       未结合的

       酶标抗体

       加底物进行

       酶催化反应

       根据颜色反应的

       程度进行该抗原

       的定性或定量测定

       间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.

       (二)间接法

       包被固相载体:

       用已知抗原包被

       固相载体

       加待检标本:

       使相应抗体与固相抗原结合

       洗涤,除去无关的物质

       加酶标抗抗体:

       与固相载体上抗原抗体

       复合物结合;洗涤,除去

       未结合的酶标抗抗体

       加底物

       显色

       根据颜色反应的程度进行

       该抗原的定性或定量测定

       (三)竞争法

       此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体 .

       用已知特异性

       抗体包被

       固相载体

       测定管加待测抗原和

       一定量的酶标抗原使二者与

       固相抗体竞争结合

       对照管只加一定量酶标抗原

       与固相抗体直接结合

       分别洗涤

       除去未结合

       的成分

       加底物显色

       分别测定两管的吸光度值,

       根据对照管与测定管吸光度值之比,

       计算标本中待测抗原含量

       对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异.如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少.因此,加入底物后显色反应较弱.

       特点一:灵敏性

       该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶.众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ,产生可供观察的显色反应现象.因此该体系常被称为酶放大体系.ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳克水平上对其进行定量.

       例如,在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml .

       特点二:特异性

       其特异性来自抗体或抗原的选择性.抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间.由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性.

       例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应.抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物.

       ELISA应用实例

       饲料中盐酸克伦特罗的测定

       饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 )

       饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )

       甲胺磷残留分析

       甲基对硫磷残留分析

       呋喃丹残留分析

       ELISA在饲料安全检测中的应用

       ELISA用于农药残留的检测

       河豚毒素

       植物毒素如**碱,吗啡,藻类毒素

       苯并芘

       主要有除草剂与杀虫剂两大类

       例如杀暝松( FN ),

       甲氟磷酸异已酶( SOMAN ),

       草不绿( Alachor ),

       西维因( Carbaryl ),

       多菌灵及克菌丹( Captan )等.

       农药的检测:

       ELISA检测 "非典型肺炎"冠状病毒

       ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体

       ELISA在疾病诊断中的作用

       ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

       ELISA试剂盒商业资讯

       ELISA试剂盒

       酶联免疫井

       DNM-9602G酶标分析仪

       DNM-9602 标配酶标分析仪

       DNM-9602A酶标分析仪

       几种酶标分析仪

       (一) 原理

        ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

       (二) 操作步骤

        方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

        1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

        2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

        3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

        4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

        5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

        6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

        方法二 用于检测未知抗体的间接法：

        用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

       (三) 试剂器材

        1. 试剂

        (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

        NaCO3　1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml

        (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml

        (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。

        (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

        (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。

        (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl

        (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl

        (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。

        (9) 正常人血清和阳性对照血清。

        2. 器材:

        (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

        (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

        (3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

       (四) 注意事项

        1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

        2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

        (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

        （2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

        (3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

        (4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

细胞凋亡的免疫学检测方法有哪几种（注意是免疫学的方法）

       楼上纯剪切党， 本人食品专业学子一枚，碰巧不久前刚做了FRAP dpph ABTS三种方法的抗氧化性评估，首先回答你的第一个问题， 我们做FRAP与dpph用的都是“当量”来表述，“当量”的意思就是样品相当于标准样（标准还原剂， 你用的是维生素C 我用的是Trolox试剂）的量， 即1g样品的抗氧化能力相当于多少标样的抗氧化能力。

       回答你的第二个问题：

       计算方法肯定和倍数相关， 其中你的表述有一些我不了解， 什么是1g粉末中提取25ML样品， 是溶解对吧， 1g样品定容至25ML我想应该是这个意思

       如果是以上我理解的意思的话那就好办了，因为标准曲线是用不同浓度的标样做的， 这个你应该了解， 同理， 你通过光度计测得的吸光值， 返回到标准曲线上的也是一个相对于标样的浓度单位， 可能是g/ml也可能是 mmol/L ， 也就是你所说的A 值吧

       R= 25/0.12*A 这就是你用那1g样品溶解出的25ml中的抗氧化性浓度，再用这个乘以你的溶解度，即0.4g/ml 再做一些单位换算即可得到样品中的抗氧化当量。

        希望能帮到你， 谢谢

蔗根和鱼腥草是同一物吗

       一、概述

       细胞凋亡（apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。凋亡一词来源于希腊语。原指花瓣、叶片的脱落。自1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理解。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体（apoptosis body）。它有别于细胞死亡（necrosis,Nec）。在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体（nucleosome）之间的连接DNA，将核小体切割成180bp～200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是机体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。

       光镜下，Apo的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。体内细胞凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其灵敏度高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。它是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近几年，人们又发现了能更快、更敏感、检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流式细胞分析术（flow cytometry，FCM 包括亚“G1”峰检测法和末端转移酶标记技术）等。本章仅介绍免疫学检测方法。

       二、ELISA法

       （一） 原理

       细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

       （二）材料与试剂

       1．采用Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

       体。

       2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体

       3．链霉亲合素包被的微孔板

       4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。

       5．ABTS底物

       6．溶解缓冲液

       7．温育缓冲液

       8．底物缓冲液

       （三）样品

       1．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200?l溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。

       2．培养细胞的上清液

       3．血浆（血清）

       （四）操作方法

       1．取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20?l上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

       2．另加入80?l免疫反应试剂 含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1∶1∶18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。

       3．取上清，用300?l温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。

       4．加入100?l底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。

       5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

       （五）结果判定

       按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

       注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸

       收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

       三、原位末端转移酶标记技术

       （一）原理

       凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。

       （二）荧光标记法

       1．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒，包括：

       ⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)1nmol/?l

       ⑵ TdT酶（25U/μl）

       ⑶ 反应缓冲液

       ⑷ 洗涤缓冲液

       ⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5?g/ml）或抗地高辛抗体（1∶30）

       ⑹ PI染液（含PI 5?g/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）

       ⑺ PBS缓冲液

       ⑻ 塑料盖玻片

       2.样品

       ⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

       ⑵ 贴壁生长的培养细胞

       ⑶ 冰冻切片

       ⑷ 常规石蜡切片

       3.操作方法

       （1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

       （2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min,三次。

       （3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。

       （4）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

       （5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。

       （6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       （7）PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

       （8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

       4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细

       胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

       (三)酶标记法

       1.材料与试剂 采用美国Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒，包括：

       ⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

       ⑵ 反应缓冲液

       ⑶ TdT酶

       ⑷ 反应终止/洗涤液

       ⑸ 平衡缓冲液

       ⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。

       ⑺ 30% H2O2

       ⑻ DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入

       0.02% H2O2。

       ⑼ 甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。

       ⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片

       2．样品 同荧光标记法。

       3．操作方法

       ⑴ 固定：同荧光标记法。

       ⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2O2缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。

       ⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤

       同上。

       ⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70?l／cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。

       ⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50?l/㎝2，18μl TdT酶+36μl反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。

       ⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       ⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min。

       ⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       ⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。

       ⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。

       ⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。

       ⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。

       ⒀ 脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。

       明胶甘油封片。

       4．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染

       色质显示出特异性的棕**。

       显微鉴别叶片表面观；上、下表皮细胞多角形，有较密的波状纹理，气孔不定式，副卫细胞4-5个；油细胞散在，类圆形，周围7-8个表皮细胞呈放射状排列。腺毛无柄，头部3-4个细胞内含淡棕色物，顶部细胞常已无分泌物、或皱缩。非腺毛（叶脉处）2-4（-10）个细胞，长180-蛐200μm，基部直径约40μm表面有条状纹理。下表皮气孔、非腺毛较多。叶肉组织中有小簇晶微在．直径6-10μm。理化鉴别1．取该品粉末适量。置小试管中、用玻棒压紧，滴加品红亚硫酸试液少量至上层粉末湿润，放置片刻，自侧壁观察，湿粉末显粉红色或红紫色。2．取该品粉末1g，加乙醇10ml，加热回流10min，滤过。取滤液2ml，加镁粉少量与盐酸3滴，置水浴中加热，显红色。3．薄层色谱①取粉末1g，加甲醇10ml，浸泡过夜，滤过。滤液浓缩至lml，作洪试液。另取金丝桃甙少许，甲醇溶解后作对照液。分取供试品及对照品适量点于同一硅胶G板上，以-甲醇-水（4.5：1：1.5），用1%的三氯化铝乙醇溶液显色，供试品色谱在与对照品色谱的相应位置上显淡**斑点，紫外光灯下呈暗棕色斑点。②取该品粉末2g，加水10ml及8%氢氧化钠8滴，冷浸2h，不断搅拌，滤过。滤液置于分流漏斗中，加醋酸乙酯10ml，7%盐酸溶液6滴，振摇5min，静置，分取醋酸乙酯提取液，作供试品溶液。另取癸酸乙醛对照品，加醋酸乙酯溶解制成每1ml含2mg溶液，作对照液。吸取供试品和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G板上，以苯-无水乙醇（7：2），喷以5%三氯化铁试液显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。药物应用鉴别鱼腥草、败酱草、红藤，三药为清热解毒之品，消痈凉血力强，为治内痈专药。其不同之处，以应用部位来说，鱼腥草多用治肺痈，败酱草多用于肠痈，红藤多用于肠痈，红藤多用于肠痈及乳痈。实验数据不同种质鱼腥草总酚、黄酮含量及其抗氧化活性提取并测定16份鱼腥草材料(含1份峨眉蕺菜)叶片总酚和黄酮含量，研究其体外抗氧化活性。方法：以95%乙醇超声提取并测定16份综合农艺性状较好的鱼腥草材料以显色及紫外分光光度测定成分含量，DPPH、ABTS法测定抗氧化活性。结果：16份鱼腥草总酚含量变异范围为7.01——15.0mg/g；黄酮含量变异范围为3.56——11.0mg/g；DPPH法抗氧化值最小为84.7μmol/g，最大为248μmol/g；而ABTS法抗氧化能力的变幅为78.4——218μmol/g。以总酚和黄酮含量、DPPH法以及ABTS法抗氧化能力进行聚类分析，按欧氏距离大于70可将16份鱼腥草材料分为两类。其中Ⅰ类包含11份鱼腥草材料(含峨眉蕺菜)，其总酚和黄酮含量低，抗氧化能力弱。Ⅱ类包含5份鱼腥草材料，其总酚和黄酮含量高，体外抗氧化能力强。总酚、黄酮含量和体外抗氧化活性指标间相关性均达极显著水平。结论：16份鱼腥草材料总酚、黄酮含量和抗氧化活性的不同，主要是由于遗传背景所致；且总酚和黄酮含量高，体外抗氧化能力强的材料多为染色体数目大于80者。选方偏方常用选方1．治肺痈吐脓吐血：鱼腥草、天花粉、侧柏叶等分。煎汤服之。（《滇南本草》）2．治肺痈：蕺，捣汁，入年久芥菜卤饮之。（《本草经疏》）3．治病毒性肺炎，支气管炎，感冒：鱼腥草、厚朴、连翘各15克。研末，桑枝50克，煎水冲服药末。（《江西草药》）鱼腥草4．治肺病咳嗽盗汗：侧耳根叶100克，猪肚子一个。将侧耳根叶置肚子内炖汤服。每日一剂，连用三剂。（《贵州民间方药集》）5．治痢疾：鱼腥草30克，山查炭10克。水煎加蜜糖服。（《岭南草药志》）6.治热淋、白浊、白带：鱼腥草40~50克。水煎服。（《江西民间草药》）7．治痔疮：鱼腥草，煎汤点水酒服，连进三服。其渣熏洗，有脓者溃，无脓者自消。（《滇南本草》）8．治慢性鼻窦炎：鲜蕺菜捣烂，绞取自然汁，每日滴鼻数次。另用蕺菜35克，水煎服。（《陕西草药》）9．治痈疽种毒：鱼腥草晒干，研成细末，蜂蜜调敷。未成脓者能内消，已成脓者能排脓（阴疽忌用）。（《江西民间草药》）10．治疔疮作痛：鱼腥草捣烂敷之，痛一、二时，不可去草，痛后一、二日愈。（《积德堂经验方》）11．治妇女外阴瘙痒，肛痈：鱼腥草适量，煎汤熏洗。（《上海常用中草药》）12．治恶蛇虫伤：鱼腥草、皱面草、槐树叶、草决明。一处杵烂敷之。（《救急易方》）常用方剂1．治疗肺脓疡：鱼腥草30克，桔梗15克，水煎服或研末冲服。2．治疗痢疾：鱼腥草20克，山楂炭6克，水煎加蜂蜜服。3．治疗流行性腮腺炎：新鲜鱼腥草适量，捣烂外敷患处，以胶布包扎固定，每日2次。4．治疗习惯性便秘：鱼腥草5～10克，用白开水浸泡10～12分钟后代茶饮。治疗期间停用其他药物，10天为一个疗程。5．治疗急性黄疸性肝炎：鱼腥草180克，白糖30克，水煎服，每日1剂，连服5～10剂。6．治疗肾病综合征：鱼腥草（干品）100～150克入开水1000毫升，浸泡半小时后代茶饮，每日1剂，3个月为一个疗程，疗程间间隔2～3日。7．治疗感冒发烧：细叶香茶菜20克，鱼腥草16克，水煎服，或将上药共研细末，煎煮滤液浓缩，并与细末混合压片，每片0.3克，每日3次，每次3～4片，小儿酌减。单方验方1．扁桃体炎、咽炎：鲜鱼腥草泡水当茶饮，或烹食炒熟当菜吃。2．尿路感染，尿频涩痛：取鲜草50克或干品30克，煎服。3．肺脓疡：鲜草洗净炒菜吃，或用鱼腥草50克，桔梗12克，甘草6克，水煎服。4．急性支气管炎、肺结核、咳嗽痰中带血：用鱼腥草30克，甘草6克，车前草30克，水煎服。5．多种皮肤病：用鲜品捣汁涂敷，或煎汁口服，均有清热消肿、除痱止痒的作用。用全草煎水外洗治天疱疮、脚癣。6．痈疖发背、疔疮肿毒（不论已破溃或未破溃）：用湿纸包裹鲜鱼腥草，置于灰火中煨熟，取出捣烂，涂敷患处。7．子宫内膜炎、宫颈炎、附件炎赤白带、及小腹痛：鱼腥草30-60克，蒲公黄、忍冬藤各30克，水煎服。8．毒蛇咬伤：取鱼腥草62.5克，盐肤木根31.25克，黄仔叶根l5.6克，飞扬草31.5克，煎水外洗用于毒蛇咬伤。9.心动过速，无血压：鲜鱼腥草50克，煎汤后冲蜂蜜15克内服。附方1、蕺菜宁肺汁：鲜鱼腥草250克，略捣，绞取汁液。一日分3次服。《滇南本草》载本品“治肺痈咳嗽带脓血。痰有腥臭”。《本草经疏》治肺痈，则用“蕺捣汁，入年久之芥菜卤饮之。”蕺菜自古为清热解毒、治疗肺痈的要药，故可单用奏效。芥菜卤有祛痰开胃之功，有利于排除痈脓，增加食欲，在治疗上亦有一定帮助，故可加用。2、蕺菜炖猪肚：鱼腥草120g，猪肚1具，将蕺菜放于猪肚中，扎定，以小火炖汤服食。鱼腥草能清肺热、解毒，在实验上对结核病变又有一定治疗意义；猪肚能补脾以益肺。用于肺痨咳嗽盗汗。3、蕺菜山楂汤：鱼腥草60克，山楂6克。加水煎汤服。源于《岭南草药志》。鱼腥草能解大肠热毒，并健胃消食；山楂能活血治痢疾，亦可消饮食。配伍应用，其效益佳。4、蕺菜车前草汤：鱼腥草60克，车前草30克。加水煎汤服。方中两者均有清热利尿、通淋之功，鱼腥草又能清热解毒。用于热淋、小便不利或湿热水肿。5、风味蕺菜：鲜鱼腥草250克，用熟食油（或熟油辣椒），盐、醋、白糖、味精拌食。[3]6食用方法凉拌做法1鱼腥草调料：盐、酱油、醋、白糖、鸡精、红油、干辣椒、花椒面鱼腥草食疗做法：1．将鱼腥草的老根、须掐去，留下嫩白根及叶片，用清水多洗几遍，洗净去泥沙，用冷水浸泡10分钟，捞出控干水分待用；也可以用开水焯一下。2．将干辣椒切成段，放到温油中炸至酥脆，发出香味，连同油一块倒入碗中待用；3．将鱼腥草放到盆里，放入盐、酱油、白糖、醋、鸡精、红油、花椒面、炸好的辣椒油拌匀，即可食用，口味可根据自己的喜好与地域的不同着相应调整。特点：麻辣酸甜，清淡爽口，是夏季餐桌上的一道佳品。提示：1.食用时鱼腥草只能吃白根和叶，食用时必须用冷水泡，消除异味。2．冬春交际时其刚吐嫩芽，味道最佳。凉拌做法2原料：1．主料：鱼腥草250克。2．调料：精盐、味精、花椒粉、辣椒油、白糖。制法：将鱼腥草去杂洗净，切成段，再用盐水泡几分钟，放味精、精盐、花椒粉、辣椒油、白糖，拌匀即可上桌。按：鱼腥草具有清热解毒、利尿消肿的功效。做成凉拌菜对上呼吸道感染、肺脓疡、尿路炎症、乳腺炎、蜂窝组织炎、中耳炎、肠炎等有一定疗效。提示：鱼腥草性寒不宜多食。鱼腥草蒸鸡鱼腥草原料：1．主料：嫩母鸡1只（重约1500克），鱼腥草200克。2．调料：精盐、味精、胡椒粉、葱段、姜片。制法：1．将鸡宰杀、去毛、内脏、脚爪洗净，放入沸水锅内焯一下，捞出洗净血污。将鱼腥草去杂洗净切段。2．取汤盆1只，放入全鸡、精盐、姜、葱、胡椒粉和适量清水，上笼蒸至鸡熟透，再加入鱼腥草、味精，略蒸即可出笼。按：此菜由清热解毒、利尿消肿的鱼腥草与温中益气、补髓添精的鸡肉相配而成，可为人体提供丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等多种营养成分，具有消炎解毒、温中益气的功效。可作为肺脓疡、虚劳瘦弱、水肿、脱肛等病症患者的辅助食疗菜看食用。鱼腥草炒鸡蛋原料：1．主料：鲜鱼腥草150克，鸡蛋4只。2．调料：精盐、味精、葱花、素油。制法：1．将鱼腥草去杂洗净切小段，鸡蛋磕入碗内搅匀。2．锅内油烧热，投入葱花煸香，放人鱼腥草煸炒几下，倒入鸡蛋一起煸炒至成块，加入适量水和盐，炒至鸡蛋熟而入味，点入味精推匀即成。按：此菜是由鱼腥草与润肺利咽、清热解毒、滋阴润燥的鸡蛋相配而组成，具有清热解毒、滋阴润肺的功效。可作为肺炎、肺脓疡、痈肿、虚劳出血、目赤、热痢等病症患者辅助营养食疗菜肴使用。[4]7文献论述鱼腥草1．《名医别录》：主蠼螋溺疮。2．《日华子本草》：淡竹筒内煨，敷恶疮白秃。3．《履巉岩本草》：大治中暑伏热闷乱，不省人事。4．《滇南本草》：治肺痈咳嗽带脓血，痰有腥臭，大肠热毒，疗痔疮。5．《本草纲目》：散热毒痈肿，疮痔脱肛，断店疾，解硇毒。6．《医林纂要》：行水，攻坚，去瘴，解暑。疗蛇虫毒，治脚气，溃痈疽，去瘀血。7．陈念祖：生捣治呕血。8．《分类草药性》：治五淋，消水肿，去食积，补虚弱，消膨胀。9．《岭南采药录》：叶：敷恶毒大疮，能消毒；煎服能去湿热，治痢疾。10．《中国药植图鉴》：可作急救服毒的催吐剂。11．广州空军《常用中草药手册》：消炎解毒，利尿消肿。治上呼吸道感染，肺脓疡，尿路炎症及其它部位化脓性炎症，毒蛇咬伤。12．广州部队《常用中草药手册》：清热解毒。治乳腺炎，蜂窝织炎，中耳炎，肠炎。食用生吃鱼腥草不习惯的人，也可以先炒或炖汤。以下为几种常见的鱼腥草的做法与鱼腥草的食疗保健：一、调理各种细菌、病毒感染，如风热感冒、疱疹、泌尿系统感染等，一定要生吃，凉拌就可以。二、预防风热感冒，炒着吃就行了。这种吃法较为温和，也适合体弱的人日常食用。正常人平时把鱼腥草当蔬菜食用保健也很好。最常见的吃法是凉拌吃，这种吃法适合大多数人。鱼腥草性寒凉，老人和体弱的人，可以用炖鸡的方法。放点香油，还有润心的作用。对于缓解夏季心神烦躁很有帮助。三、产妇在月子里第一次吃鸡的时候，一定要放些鱼腥草，可以预防产后风。9主要功效清热解毒，利尿消肿。治肺炎，肺脓疡，热痢，疟疾，水肿，淋病，白带，痈肿，痔疮，脱肛，湿疹，秃疮，疥癣。1、增强免疫系统作用，提高慢性气管炎患者白血球的吞噬作用。2、抗病原微生物作用，抑制金**葡萄球菌、流感杆菌、肺炎双球菌。3、抗肿瘤作用，提高癌细胞中的CAMP而抑制艾氏腹水癌。4、利尿作用，使毛细血管扩张，增加肾血流量及尿液分泌，所以也用于尿路感染的频尿涩痛。10食疗功效1、抑制流感：鱼腥草全株均可入药，对流感病毒、肺炎菌有明显的抑制作用，还有解毒、清热、镇痛、止咳、顺气、健胃等医疗作用，外用可治疗疥癣、湿疹、痔疮等症。2、乌发：鱼腥草可促进头发生长，合白发变黑，且有滋补强身之效。3、抵制细菌：鱼腥草中含于腥草素等挥发油成分，对金**葡萄球菌、白色葡萄球菌、痢疾杆菌等均有一定抑制作用。4、增强免疫力：鱼腥草素和鱼腥草煎剂均能明显促进白细胞的吞噬能力，增进机体免疫功能。鱼腥草所含大量钾盐有利尿作用。5、改善毛细血管脆性：鱼腥草能改善毛细血管脆性、抑制浆液分泌、促进组织冉生，有助于镇痛、止血、止咳，作为药物主治肺炎、百日咳、气管炎、乳腺炎、中耳炎等症，具有很高的药用价值。[5]

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